Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡(jiǎn)單，廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段。上海血液RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商

Real-time PCR式反應(yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計(jì)方法，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同。上海骨頭熒光PCR研究方案PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性。

Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時(shí)間過長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

Real-time PCR反應(yīng)：多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過同時(shí)靶向多個(gè)基因，可以從單次測(cè)試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時(shí)間來執(zhí)行。每個(gè)引物組的退火溫度必須優(yōu)化，以在單個(gè)反應(yīng)中正確工作，并符合擴(kuò)增子尺寸。也就是說，當(dāng)通過凝膠電泳可視化時(shí)，它們的堿基對(duì)長(zhǎng)度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析。上海微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理

因?yàn)镽eal-time PCR的檢測(cè)靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。上海血液RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商

引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子，不能在一個(gè)外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來擴(kuò)增的，如果有DNA污染的話，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）。2，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度，方便于以后同時(shí)擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費(fèi)模板，浪費(fèi)管家基因，所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)有利。上海血液RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商